Gratias tibi ago pro natura.com adire. Versio navigatoris utens quam subsidia limitata CSS habet. Ad optimam experientiam commendamus ut navigatro renovato uteris (vel inactivare Compatibilitas Modus in Penitus Rimor). Interea, ut subsidia continua conservent, locum sine stylis et JavaScript reddemus.
Thermophilae sunt microorganismi quae in calidis temperaturis vigent. Eos perscrutantes praebere possunt magni pretii informationes quomodo vita extrema condicionibus adaptetur. Sed difficile est condiciones calidissimas consequi cum microscopiis conventionalibus opticis. Multae solutiones domesticae factae fundatae in calefactione electrica resistentia locali propositae sunt, sed nulla solutio commercialis simplex est. In hac charta notionem laseris microscales calefactionis per microscopii campum visum ad altas temperaturas studiorum thermophilarum, servato ambitus mitis usoris, praebere. Microscale calefactio ad intensionem laseris modicam effici potest utens auri nanoparticulae subiectae, sicut biocompatibilis et lux absorbentis efficientis. Effectus possibilis fluidi microscale convection, retentio cellae, et motus thermophoreticus centrifuga discutitur. Methodus in duabus speciebus demonstrata est: (i) Geobacillus stearothermophilus, bacterium thermophilicum activum, quod fere 65°C producit, quam germinare, crescere, et sub microscale calefactione natare observavimus; (ii) Thiobacillus sp., optime hyperthermophilic archaea. ad 80°C. Hoc opus viam sternit ad simplicem et tutam observationem microorganismatum thermophilicorum utentium instrumentorum microscopii moderni et parabilis.
Plus billions annorum, vita in terra efficitur ut amplis condicionibus environmental, quae interdum extremae ab hominum prospectu considerantur. Speciatim quidam microorganismi thermophilici (bacteria, archaea, fungi) vocantur thermophili in range temperatura vigent ab 45°C ad 122°C1, 2, 3, 4. Thermophili in variis oecosystematibus habitant, ut hydrothermalia maris profunda, fontes calidi. vel molaris. Investigationes in his decenniis multum interest per hos duos saltem de causis. Ex iis primum discere possumus, exempli gratia, quomodo thermophiles 5, 6, enzymes 7, 8 et membranulae 9 in tanta temperaturae stabilitate sint, aut quomodo thermophilae extremas radiorum gradus sustinere possint. Secundo fundantur multis applicationibus biotechnologicis 1,11,12, ut cibus productionis 13, 14, 15, 16, synthesis chemica (dihydro, alcohols, methano, amino acida, etc.) 17, biomining 18 et biocatalystae thermostabiles 7 ,11; XIII. Praesertim, catenae polymerase notae nunc reactionis (PCR)19 enzyme (Taq polymerase) solitariam a bacterio thermophilico Thermus aquaticus, unus e primis thermophilis aquaticis, involvit.
Attamen studium thermophilarum facile non est opus nec in aliquo laboratorio biologico evenire potest. Speciatim thermophili vivi in vitro observari non possunt cum aliqua levi microscopii norma, etiam cum commercio promptuarium calefactionis camerae, solere aestimari pro temperaturis tam male quam 40°C. Ab annis 1990, pauci coetus investigationis se dederunt introductioni systemata altae temperaturae microscopii (HTM). In 1994 Glukh et al. Cubiculum calefactionis/refrigerium conceptum est in usu cellae Peltier quae temperatura rectangularum capillarium clauditur ad anaerobicitatem conservandam moderatur 20 . Cogitatus calefieri potest usque ad C °C ad ratem 2°C/s, auctoribus inspiciendi mobilitatem bacterii hyperthermophilici Thermotoga maritima21. Anno 1999 Horn et al. A simillima fabrica evoluta est, adhuc in usu capillariorum calefactorum accommodata microscopio commerciali ad divisionem cellam discendi / connexionem. Post longum tempus relativae inertiae, quaesitio efficax HTMs in anno 2012 resumpta est, praesertim in nexu cum serie chartarum catervarum a Wirth quae fabrica ab Horn et al inventae usus est. Abhinc quindecim annos mobilitas magnae numeri archaeae, cum hyperthermophilae, temperaturae usque ad 100°C pervestigata est utens capillaribus calefactis 23,24. Etiam microscopium originale modificaverunt ut citius calefaciendo (plures minuta pro 35 minutis ad temperiem statutam perveniant) et linearem clivum temperatura plus quam 2 cm per medium efficiant. Haec temperatura gradientis artificii effingendi (TGFD) adhibita est ad investigandam mobilitatem plurium thermophilorum in gradibus caliditatis ad distantias biologicas pertinentes 24, 25 .
Calefaciens capillaria clausa non solum est ad servandum thermophilas vivas. In MMXII, Kuwabara et al. Class aptent taciti cubicula Pyrex signata cum tenaces calore repugnant (Super X2; Cemedine, Iaponia) adhibitae sunt. Exempla ponuntur in commercio in promptu laminae calefactionis perspicuae (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Iaponia) calefieri ad 110°C, sed non primum destinata ad bioimaginationem. Auctores observaverunt divisionem efficientis bacteria anaerobicae thermophilicae (Thermosipho globiformans, duplicato tempore 24 min) ad 65°C. In 2020, Pulshen et al. Acetabula efficiens calefactio metalli commercialis (AttofluorTM, Thermofisher) demonstratum est duobus elementis calefactis homemade adhibitis: operculo et scaena (PCR machinarum figurarum inspiratarum). Consociatio haec in liquida temperatione uniformi resultat et evaporationem et condensationem in ima operculi prohibet. Usus anuli o-anuli vitat gasi permutationem cum ambitu. Hoc HTM, Sulfoscope appellatum, ad imaginem Sulfolobus acidocaldarium 75°C27 adhibitum est.
Limitatio omnium istorum systematum agnita erat restrictio ad usum objectorum aeris, quaevis immersio olei ad tantam caliditatem idoneam et ad imaginandum per >1-mm crassum exempla pellucida. Limitatio omnium istorum systematum agnita erat restrictio ad usum objectorum aeris, quaevis immersio olei ad tantam caliditatem idoneam et ad imaginandum per >1-mm crassum exempla pellucida. епризнанным недостатком всех тих систем было ограничение на использование воздушных объективов, поективол ружение в асло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации ерез прозрачные орачные орачные о. Defectus omnium horum systematum agnitus fuit limitatio ad usum objectorum aeris, quia quaevis immersio olei tanta caliditate et ad visualizationi per diaphana exempla >1 mm crassa non erat idonea.> 1 Limitatio omnium horum systematum agnita est limitatio utendi speculi aere exercitato, sicut quaevis immersio olei idonea est ad exempla imaginandi diaphanum >1 mm crassum in tanta caliditate. епризнанным недостатком всех тих систем является ограниченное использование воздушных объективов,; в асло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы толщиной>1 иной>1 толщиной Incommodum agnitum omnium horum systematum est limitata usus lentium aeris, quaevis immersio olei tam idonea temperaturae et visualisationis per exempla perspicua >1 mm crassa est.Recentius haec limitatio a Charles-Orzag et al. 28, qui excogitavit machinam non amplius calori circa systema usuris praebet, sed intra ipsum vitreum operculum, tenui pellucido strato resistentis ITO (indium-tin oxydi factum). Operculum calefieri potest usque ad 75 °C transeundo venam electricam per lavacrum diaphanum. Sed auctor etiam lentem calefacere debet ad objectum, sed non plus 65 °C, ut non laedat.
Haec opera ostendunt progressionem efficientis summus temperaturae microscopiae opticae non late receptam esse, saepe apparatu homemade requirit et saepe consecutus est cum resolutione locali, quod grave incommodum datur quod microorganismos thermophilicos non pauciores esse. micrometers. Volumen calefactivum reductum clavis est ad solvendas tres problemata inhaerentia HTM: pauperes resolutio localis, alta inertia thermarum cum ratio calefacit, et nociva calefactio elementorum circumiacentium (oleum immersio, obiectivum lens… vel manus usoris) in temperaturis extremas. ).
In hac charta, observationes thermophilae in HTM inducimus quae resistentiae calefactionis non fundatur. Sed calefactionem localem consecuti sumus in regione limitata visui microscopii per irradiationem laseris substratae lucis absorbentis. Temperatura distributio subjicitur per microscopiam quantitatis Phase (QPM). Efficacia huius methodi demonstratur Geobacillus stearothermophilus, motile thermophilicum bacterium quod circiter 65°C producit et breve tempus duplicatum (circiter 20 minuta) habet, et Sulfolobus shibatae, hyperthermophilus optime in 80°C (archaea) crescens. illustrare. Normalis replicatio rate et swimming quod functio temperaturae observata sunt. Haec laser HTM (LA-HTM) non circumscribitur crassitudine operculorum vel a natura obiecti (aeris vel olei immersionis). Hoc permittit quodlibet lens senatus in foro utendum. Etiam calefactio tarda propter inertiam thermarum (instanti calefactione consequitur in scala millii secunda) et utitur tantum ad commercium in promptu componentibus. Solae novae salutis sollicitudines ad praesentiam potentium radiorum laseris (typice usque ad 100 mW) referuntur intra machinam et fortasse per oculos, quae tutelae goggles requirunt.
Principium LA-HTM est laser ad calefaciendum specimen locale in campo visum microscopii (fig. 1a). Ad hoc exemplum levis hauriendi debet esse. Utendi potentia laseris rationalis (minus quam 100 mW), non nitimur effusio lucis per liquidum medium, sed artificiose absorptionem specimen auxit per tunicam auri nanoparticulam subiectam (Fig. 1c). Aurum nanoparticula calefacere cum luce maximi momenti est ad campum plasmonica thermarum, cum applicationes in biomedicina, nanochemistica vel solis messe 29.30,31. Praeteritis his paucis annis hoc LA-HTM in pluribus studiis ad plasma thermarum applicationum physicae, chemiae et biologiae pertinentibus usi sumus. Summa difficultas cum hac methodo est in ostentatione finali temperaturae figurae, quia temperatura elevata intra regionem microscale intra specimen limitatur. Demonstravimus temperaturam destinata fieri posse cum tondente interferometro transverso quattuor necem, simplicem, altam resolutionem, ac sensibilem methodum quantitatis phase microscopii secundum usum diffractionis craticularum duarum dimensivarum (etiam notarum craticularum crucis) 33,34,35,36. Fiducia huius technicae artis microscopii, quae in microscopio undante craticulae transiit (CGM), in duodecim libellis super praeteritum decade37,38,39,40,41,42,43 editis demonstratum est.
Schema institutionis laseris parallelae calefaciendi, conformandi et microscopii temperandi. b Sample geometria ex AttofluorTM cubiculi constans continens opercula auri nanoparticularum obducta. c Inspice specimen (non scandere). d figuram laseris aequabilem repraesentat et (e) temperatura subsequentis simulatam distributionem in plano sample nanoparticulorum auri repraesentat. f est tabula laseris annularis profile apta ad generandam temperiem uniformem ut patet in simulatione consequentis distributionis temperaturae exhibitae (g). Scala: 30 µm.
Praesertim nos nuper calefactionem cellularum mammalium cum LA-HTM et CGM consecuti sumus et cellularum calorum impulsus responsa perscrutatus est in latitudine 37-42°C, demonstrans applicabilitatem huius artis ad cellulam vivam imaginandi. Attamen applicatio LA-HTM ad studium microorganismi ad altas temperaturas non est unambiguum, quod cautius requirit comparatum cellulis mammalibus: primo, calefacere fundum medii per decem gradus (quam paucos gradus) ducit. forti verticali temperatus clivus. potest creare convection fluidum 44 qui, nisi firmiter adhaeret subiectae, motum et permixtionem bacteriae inconveniens causare potest. Haec convection tolli potest reducendo crassitiem liquoris iacui. Ad hoc, in omnibus experimentis infra exhibitis suspensiones bacterial inter duo opercula circiter 15 µm crassa, intra poculum metallicum positi (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c). In principio, convection vitari potest si crassitudo liquoris minor est quam trabes magnitudine calefactionis laseris. Secundo in tali geometrica limitata laborantes organismos aerobicos suffocare possunt (cf. Fig. S2). Quaestio haec vitari potest utendo subiectam quae permeabilis oxygeni (vel quovis alio gasi vitali), relinquendo bullas aeris inclusas intra operculamenti, vel per artem foramina in summitate opercularum (vide Fig. S1) 45 . In hoc studio solutionem postremam elegimus (Figura 1b et S1). Denique calefactio laser non praebet uniformem temperiem distributionem. Etiam in eadem intensio trabes laseris (fig. 1d), temperatura distributio uniformis non est, sed potius assimilatur distributioni Gaussianae ob diffusionem thermarum (fig. 1e). Cum propositum est temperaturas accuratas constituere in campo intuitu ad systema biologicum investigandum, profile inaequalia non sunt ideales et etiam ad motum bacteria thermophoreticum ducere, si subiecto non adhaerent (cf. Fig. S3, S4)39. Ad hunc finem modulatorem spatialem (SLM) usi sumus, ut trabem laseris ultrarubrum secundum figuram anuli (fig. 1f) figuraret in plano exempli, ut distributionem temperatam perfecte uniformem in data area geometrica consequendam; Quamvis diffusio thermarum (Fig. 1d) 39, 42, 46. Pone top coverlip super catino metallico (Figura 1b) ad evaporationem medii vitandam et per aliquot saltem dies observandum. Quia hoc opercula capitis sui signatum non est, medium adiectum facile quovis tempore, si opus est, addi potest.
Ad illustrandum quomodo opera LA-HTM eiusque applicabilitatem in thermophilica investigatione demonstraremus, studuimus bacteria aerobica geobacillus stearothermophili, quae optimam incrementum temperie circa 60-65°C habent. Bacterium etiam flagella et natandi facultatem habet, praebens aliud signum actionis cellularum normalium.
Exempla (Fig. 1b) pre-incubata 60°C unius horae ac deinde in LA-HTM specimen possessoris positae sunt. Haec prae-incubatio libitum est, sed tamen utile, duabus de causis: Primum, cum laser in se vertitur, cellulas statim crescere et dividere facit (vide pellicula M1 in Materiis Supplementariis). Sine prae-incubatione, bacterial incrementum typice moratum est per circiter 40 minutas singulis diebus novum spatium inspectionis in sample calefactum. Secundo, hora 1 prae-incubationis adhaesio bacteria ad operculamenta promovenda est, quo minus cellulae e regione prospectus effervissent ob thermophoresim cum laser conversus est (vide pelliculae M2 in Accessiones Materiae). Thermophoresis est motus particularum seu molecularum secundum clivum temperatum, plerumque ab calido ad frigidum, et bacteria non sunt exceptiones 43, 47. Hic effectus inconveniens super datam aream eliminatur utendo SLM ad trabem laseris figurandam et ad distributionem plana temperatura consequendam.
Pridie fici. Figura 2 ostendit distributionem temperaturam per CGM mensuratam impetratam irradiando substratum vitreum obductis nanoparticulis aureis cum annali laseris trabes (fig. 1 s). Distributio temperatura plana observata est per totam aream ab laseris trabe tectam. Haec zona ad 65°C posita est, optimum incrementum temperatura. Extra hanc regionem curva temperatura naturaliter cadit in \(1/r\) (ubi \(r\) est coordinata radialis).
Tabula Temperature mensurarum CGM consecuta utendo laser trabem annularem ad irradiandum iacum auri nanoparticulorum ad obtinendum profile temperatura plana super aream circularem. b Isotherm de tabula temperatura (a). Extima trabis laseris per circulom cinereum punctatum repraesentatur. Experimentum bis repetitum est (vide Materias Supplementarias, Figure S4).
Viability bacterial cellularum LA-HTM adhibitis per aliquot horas monita est. Pridie fici. 3 tempus ostendit quattuor imagines sumptas ab hora 3 hora 20 minutissima pellicula (Movie M3, Accessiones Informationes). Bacteria observata sunt ut active proliferarentur in ambitu circulari laser definito, ubi temperatura optima erat, appropinquans 65°C. E contra, incrementum cellularum signanter imminutum est cum temperatura infra 50°C pro 10 s cecidit.
Imagines profunditatis opticae G. stearothermophili bacteria crescentis post laser calefactionem diversis temporibus, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, e 200 Extractum ex cinematographico one-minuti (M3 cinematographico in supplementario Informationis provisum) superimponitur in tabula temperatura respondente. Laser volvitur in tempore \(t=0\). Isotherms imaginis vehementiae additae sunt.
Ad augendum incrementum cellae et eius dependentia a temperatura, auctum taedium variarum coloniarum initiorum bacteria separatarum in Movie M3 agro visum (fig. 4) metivimus. Parent bacteria electa in initio mini coloniae formationis unitatis (mCFU) in Figura S6 monstrantur. Mensurae massae aridae ductae sunt cum CGM 48 camera, quae ad distributionem temperaturam describendam adhibita erat. Facultas CGM metiri siccum pondus ac temperamentum est fortitudo LA-HTM. Sicut expectatur, caliditas caliditas incrementum bacterial effecit (Fig. 4a). Ut in semi-logali argumento in Fig. 4b, incrementum in omnibus temperaturis sequitur incrementum exponentiale, ubi data functione exponentiali utitur \(m={m}_{0}{10}^{t/\tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), ubi \(\tau{{{{\rm{log }}}}}}2\) - tempus generationis (vel tempus duplicatum), \( g =1/ \tau\) - incrementum rate (divisionum numerus per tempus unitas ). Pridie fici. 4 c ostendit respectivum incrementum rate et generationem tempus ut functionem caliditatis. Celeriter crescens mCFUs notatur per satietatem incrementi post duas horas, mores expectati propter altam densitatem bacterial (similis periodo stationario in liquidis culturarum classicis). Figura generalis \(g\sinistrae(T\right)\) (Fig. 4c) correspondet curvae phase exspectatae pro G. stearothermophilo cum optimali incremento circa 60-65°C. Par notitias utens exemplar cardinali (Figura S5)49 ubi \(\reliquit({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1.6; 67 ± 3) °C, quod bene convenit cum aliis valoribus in litteris citatis. Quamvis parametri dependens temperatura reproducibilia sint, maximum incrementum rate \({G}_{0}\) ab experimento in aliud variari potest (vide figuras S7-S9 et pellicula M4). E contra parametri temperaturae congruentes, quae universales esse debent, maximum incrementum rate dependet a proprietatibus medii (disponibilitatis nutrimentorum, retrahitur oxygeni) intra microscale geometriae observatae.
Microbial incrementum in variis temperaturis. mCFU: Colonia Miniatura Formans Unitates. Data consecuta est ex gyro unius bacterii crescentis in gradiente temperato (movie M3). b Idem ac (a), scala semi-logarithmica. c Augmentum rate (\tau) et generationis tempus(g\) computatum a regressione lineari (b). Horizontalis error vectes: temperatura vagans quibus mCFUs in campum prospectus per incrementum dilatatur. Error verticalis vectes: regressio linearis vexillum errorum.
Praeter normalem incrementum, nonnulla bacteria interdum in calefactione laseris in conspectum natabant, quae mores sperati bacteria cum flagella sunt. Pellicula M5 in informationis informationis tales actiones natandi ostendit. In hoc experimento, radiatio laser uniformis adhibita est ad movendum clivum temperatum, ut in figuris 1d, e et S3 ostensum est. Figura 5 ostendit duo sequentia imaginis e pellicula M5 selecta ostendens unum bacterium ostendit motum directionalem, dum ceterae bacteria immotae manent.
Duo temporis tabulae (a) et (b) natationem ostendunt ex duabus diversis bacteria circulis punctatis notata. Imagines ex pellicula M5 extractae sunt (provisum ut materia addita).
In casu G. stearothermophili, motus activus bacterii (Fig. 5) incepit paucis secundis post trabem laser in verso. Haec animadversio extollit responsionem temporalem huius microorganismi thermophilici ad augmentum caliditatis, sicut iam a Mora et al observatum est. [24]. Thema motilitatis bacterial et etiam thermotaxis ulterius explorari potest utens LA-HTM.
Microbialis natatio confundi non debet cum aliis speciebus motus corporis, nempe (i) motus Browniani, qui videtur esse motus chaoticus nullo certo directione, (ii) convection 50 et thermophoresis 43, constans in motu regulari secundum temperaturam. clivus.
G. stearothermophilus cognoscitur propter facultatem sporis (formationis sporarum) valde repugnantes producendi, cum condiciones environmentales adversas tamquam defensionem expositae sunt. Cum condiciones environmental secundo iterum fiunt, sporae germinant, cellulas vivas efformant et incrementum sumunt. Quamquam haec processus sporulation/germinationis notum est, numquam in tempore reali observatum est. Utentes LA-HTM, hic referimus primam germinis rerum observationem in G. stearothermophilo.
Pridie fici. 6a imagines profunditatis opticae (OT) temporis lapsus ostendit adhibitis CGM statuto 13 sporis. Totius enim collectionis tempus (15 h 6 min, \(t=0\) - principium calefactionis laseris), 4 e 13 sporis germinatis, tempore continuo puncta \(t=2\) h, \( 3\. ) h \(10\)', \(9\) h \(40\)' et \(11\) h \(30\)'. Quanquam una tantum harum eventuum in Figura VI ostenditur, 4 eventa germinatio observari potest in M6 pellicula in materia accessione. Interestingly, germinatio videtur esse temere: non omnes sporis germinant nec simul germinant, non obstante easdem mutationes in condicionibus environmental.
tempus-lapsum constans ex 8 OT imaginibus (immersio olei, 60x, 1.25 NA objecti) et (b) evolutionis biomass G. stearothermophili aggregata. c (b) Tractus in scala semi-loga ad exaggerandam linearitatem in incrementi rate (linea allisa).
Pridie fici. 6b, c ostendit taeda incolarum cellularum in campo prospectui tamquam functio temporis per totum periodum notitiae collectionis. Fastidium massae aridae in \(t=5\)h in fig. 6b, c, ob fauces cellularum e campo visum. Horum quattuor eventuum incrementum est \(0.77\pm 0.1\) h-1. Haec valor altior est quam rate incrementum cum Figura 3. 3 et 4, ubi plerumque cellulae crescunt. Ratio incrementi G. stearothermophili e sporis auctis obscura est, sed hae mensurae interest LA-HTM extollere et operare in gradu cellula unius (vel in uno mCFU gradu) ut plus discas de dynamicis vitae cellae. .
Ad ulteriorem conversionem LA-HTM eiusque ad temperaturas activitates demonstrandas, incrementum Sulfolobi shibatae, hyperthermophilicum archaeam acidophilicum cum optima augmento temperatura 80°C51 examinavimus. Comparata G. stearothermophilo, haec archaea etiam morphologiam longe diversam habent, sicut 1 sphaeris micron (cocci) magis quam baculi elongati (bacilli).
Figura 7a constat ex sequentiae profunditatis opticae imagines S. shibatae mCFU adhibitis CGM consecutis (vide M7 pluma pellicularum in Materiis Supplementariis). Hoc mCFU crescit circa 73°C, infra optimam temperiem 80°C, sed intra extensionem caloris ad incrementum activum. Plures eventus fissiones observavimus quae mCFUs factae apparent sicut micrograpes archaeae post paucas horas. Ex his OT imaginibus, taeda mCFU supra tempus mensurata est, et in Figura 7b exhibita. Interestingly, S. shibatae mCFUs incrementum lineari ostendit potius quam exponentiale incrementum cum G. stearothermophilo mCFUs visum. Diuturna disceptatio 52 fuit de natura incrementi cellae: dum alii studia referunt rates incrementi microbes, quae pro magnitudine sua proportionales sunt, alii constantem ratem (linearibus vel bilineis proventibus demonstrant). Sicut explicatur a Tzur et al.53, inter exponentialem et (bi) incrementum linearem distinguens praecisionem <6% in mensuris taedi, quae semoto ad plures artes QPM, etiam interferometriam involvendas, requirit. Sicut explicatur a Tzur et al.53, inter exponentialem et (bi) incrementum linearem distinguens praecisionem <6% in mensuris taedi, quae semoto ad plures artes QPM, etiam interferometriam involvendas, requirit. ак объяснили Цур и др.53, различение кспоненциального и (би)линейного роста требует точности <осен иости <6% в зм иости ижимо для ольшинства етодов QPM, даже с использованием интерферометрии. Ut explicatur a Zur et al.53, inter exponentialem et (bi) incrementum linearem distinguens requirit <6% accurationem in mensuris taedi, quae pluribus modis QPM attingi non potest, etiam interferometria utens.Sicut dictum est per Zur et al. 53, distinguens inter exponentialem et (bi) incrementum linearem minus quam 6% accurationem in mensuris taedae requirit, quae pluribus modis QPM attingi nequit, etiam cum interferometria adhibetur. CGM hanc accurationem cum subtilitate sub-pg in mensuris taedis 36,48 consequitur.
tempus-lapsum constans 6 OT imaginum (immersio olei, 60x, NA objecti 1.25) et (b) evolutionis Micro-CFU biomass cum CGM mensurata. Vide movie M7 pro magis notitia.
Proventus perfecte linearis S. shibatae inopinatus fuit et nondum nuntiatus est. Attamen incrementum exponentialis expectatur, saltem quod per tempus multiplices divisiones 2, 4, 8, 16 ... cellulae fieri debent. Hypothesimus linearem incrementum posse ob cellam inhibitionis ob densa cellularum sarcinam esse, sicut incrementum cellulae retardat ac tandem attingit statum sopitam cum densitas cellae nimis alta est.
Concludimus per haec quinque puncta de usuris invicem tractando: reductionem in calefactione voluminis, reductionem in inertia thermarum, usuram in auri nanoparticulis, usuram in microscopio quantitatis phase, et possibilem extensionem temperamenti qua LA-HTM adhiberi potest.
Comparatus ad calefactionem resistentiae, laser calefactio adhibita pro HTM evolutione multa praebet utilitates, quas in hoc studio illustramus. Praesertim, in instrumentis liquidis in regione microscopii inspicienda, volumen calefactivum intra paucos 10 µm) libros continet. Hoc modo, solum microbes observatae activae sunt, cum aliae bacteria sopitant et adhiberi possunt ad exemplum ulterioris investigationis — non opus est ut omni tempore nova temperatura nova temperie sedanda. Praeterea, microscale calefactio directam examen magnae temperaturarum temperaturarum concedit: Figura 4c ex pellicula 3 horarum (Movie M3) consecuta est, quae plerumque requirit praeparationem et examen plurium exemplorum - unum pro singulis exemplaribus sub studio. y est temperatura numerum dierum in experimento repraesentans. Reducendo volumen calefactum etiam omnia membra circum optica microscopii, praesertim lentis obiectiva, in temperatura cella servat, quae quaestio major tam longe versatur a communitate. LA-HTM adhiberi potest cum quavis lens, incluso lensum immersione olei, et in cella temperie etiam cum extrema temperatura in agro intuitu remanebit. Praecipua limitatio methodi calefactionis laseris quam in hoc studio referimus est cellulas quae non adhaerent vel natant longe ab aspectu et studio difficili. Workaround esse potest uti humili magnificatione lentium ad maiorem caliditatem oriatur in excessu paucorum microns centum. Haec cautio cum resolutione locali decrescit, sed si finis motus microorganismi studere debet, resolutio localis alta non requiritur.
Tempus scalae calefactionis (et refrigerationis) systematis \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) ex magnitudine sua pendet , ex lege \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), ubi \ (L\ ) Fons caloris proprietas est (diameter trabes in studio nostro est \(L\ circiter 100\) μm), \(D\) est diffusivitas thermarum ambitus (mediocris nostris. casus, vitreus et aqua, diffusio rate\(D\ circiter 2\{10}{-7}{10} m2/s) m2/s). Mutationes temperatae expectari possunt. Haec instantanea temperaturae erectio non solum experientiae durationem minuit, sed etiam tempus certum temporis \(t=0\) admittit pro aliquo studio dynamico caloris effectus.
Methodus proposita nostra applicabilis est cuilibet substratae lucis absorbentis (exempli gratia, exempla commercialia cum ITO efficiens). Attamen, auri nanoparticuli effusio ultrarubrum et humilem effusio in visibili extensione possunt praebere, quarum notae posterioris interest ad observationem opticam efficacem in ambitu visibili, praesertim cum utens fluorescens. Praeterea aurum biocompatibile est, chemica iners, densitas optica ab 530 um ad infrarubrum prope accommodetur, et praeparatio specimen specimen est simplex et oeconomicum.
Craticula transversalis undarum ante microscopium (CGM) non solum ad microscale destinata temperatura permittit, sed etiam taeda magna vigilantia, eamque apprime utilis (si non necesse est) in compositione cum LA-HTM permittit. Praeteritis decenniis aliae microscopiae temperatae artes ortae sunt, praesertim in campo bioimaging, et pleraeque earum usum probes-sensitivum fluorescentium temperaturae requirunt 54,55. Tamen hae methodi reprehensae sunt et nonnullae relationes temperaturas univocum mutationes intra cellulas mensuraverunt, fortasse ex eo quod fluorescens ex multis causis praeter temperaturam pendet. Praeterea pervestigationes fluorescentes maxime instabiles sunt in calidis caliditatibus. Ideo QPM et in specie CGM repraesentant microscopiam temperatam optimam technicam ad vitam investigandam in calidis temperaturis microscopio optica utentes.
Studia S. shibatae, quae optime vivunt in 80°C, ostendunt LA-HTM applicari posse ad hyperthermophilos studiosos, non ad thermophilos simplices. Principio nullus modus est ad temperaturas extensiones qui utendo LA-HTM attingi possunt, atque etiam supra 100°C temperaturas sine ferventi atmosphaerico pressione attingi potest, ut demonstratum est a nostro coetu 38 in applicationibus chemiae hydrothermae ad atmosphaericum. pressionis A. laser adhibetur ad nanoparticulas auri calefaciendas eodem modo 40 . Ita LA-HTM potentia adhibenda est ad hyperthermophilos inauditos observandos cum norma alta resolutionis microscopii optica sub normarum conditionibus (id est sub accentus environment).
Omnia experimenta facta sunt per microscopium homemade, inclusa illuminatione Kohler (cum LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), specimen possessor cum xy manuali motuum, objectorum (Olympi, 60x, 0,7 NA, aeris, LUCPlanFLN60X vel 60x, 1.25 NA, Olei , UPLFLN60XOI), CGM cameram (QLSI crucis aeneam, 39 µm picem, 0,87 mm ab Andor Zyla sensorem cameram) ad intensionem et imaginationem fluctuantem praebeat, et cameram (ORCA Flash 4.0 V3, 16-bit modus, ab Hamamatsu) notet. data in Figura V (bacterial swimming). Trabs dichroica SCHISMATICUS 749 um BrightLine in ore est (Semrock, FF749-SDi01). Colum in fronte camerae est 694 colum brevium passuum (FF02-694/SP-25, Semrock). Titanium laser sapphirus (Laser Verdi G10, 532 um, 10 W, cavum laser tsunami exantlatum, Spectra-physicum fig. 2-5, ulterius substituitur Millenia laser, Spectraphysica 10 W, cavum laseris exantlaratum, Coherent, pro Fig. -5). 6 et 7) collocantur ad necem \({{({{\rm{\lambda }}}}}}=800\) um, quod respondet spectro auri nanoparticuli plasmonae resonanti ({{{{{}{)(({\rm) \lambda 1152 elementa) empta sunt ab Optica Meadowlark.
Crux craticulae fluctuans in microscopio (CGM) est ars microscopia optica innixa, coniungens diffractionem duarum dimensivarum craticularum (etiam nota crucis craticulae) ad distantiam unius millimetri a conventionali sensore camerae. Frequentissimum exemplum CGM quo in hoc studio usi sumus, vocatur transversio transversalis quattuor neces interferometer (QLSI), ubi crux craticulae consistit in intensione/phase tessellati exemplaris a Primot et al introducti et patenti. 200034. Lineae craticulae verticales et horizontales in sensori euismod similes umbrae creant, quarum depravatio numero in reali tempore discursum esse potest, ut obtrectatio optica fluctuantis (vel aequivalens periodi profile) lucis incidentis efficiat. Cum in microscopio usus est, camera CGM viam opticam differentiam obiecti imaginati, etiam profunditatis optici notae (OT), cum sensibilitate in ordine nanometrorum ostendere potest. In mensura quavis CGM, ad tollendos quosvis defectus in componentibus vel radiis opticis, prima relatio OT imago sumenda et subtrahenda est a quibusvis imaginibus subsequentibus.
Microscopia temperaturae fiebat utens camera CGM de qua in relatione descriptus est. 32. Denique liquor calefaciens suum refractivum indicem mutat, lens thermas efficiens effectum qui trabem incidentem distorquet. Haec depravatio fluctuationis CGM mensuratur et discursum est utens deconvolutione algorithmus ad distributionem trium dimensiva temperatura in medio liquido. Si auri nanoparticulae per specimen aequaliter distributae sunt, temperatura destinata fieri potest in bacteria liberorum arearum ad imagines meliores producendas, quod interdum facimus. Imaginis relatio CGM sine calefactione acquisita est et postea in eodem loco in imagine cum laser on capitur.
Mensurae massae aridae effectum est utendo eadem camera CGM ad imaginandi temperaturam adhibita. Imagines referentiae CGM consecutae sunt a celeri movente specimen in x et y in expositione sicut medium inhomogeneitatis fere in OT ob praesentiam bacterii. Ex OT imaginibus bacterii, eorum taeda consecuta est utens ensemble imaginum super areas electas utens algorithmus Matlab's homemade segmentation (vide subsection "codex numeralis"), sequens modum de quo in ref. 48. Denique utimur relatione \(m={\alpha}^{-1}\iint{\mbox{OT}}}\ left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), ubi \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) est imago profunditatis optica, \(m\) est siccum pondus ac \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) constans est. Elegimus \({{{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg, quod est typicum constans erga cellulas vivas.
Operculum lapsus 25 mm in diametro et 150 µm crassum, nanoparticulis aureis obductis, in cameram AttofluorTM (Thermofisher) cum nanoparticulis aureis spectantibus ponebatur. Geobacillus stearothermophilus pernoctare in LB medio (200 rpm, 60°C) ante singulos dies experimentorum precultus est. Gutta 5 µl suspensionis G. stearothermophili cum densitate optica (OD) 0,3 ad 0,5 posita est in operculo lapsus cum nanoparticulis aureis. Deinde operculum rotundum 18 mm diametro cum foramine 5 mm diametro cum foramen 5 mm in centro in guttam demissum est, et 5 µl suspensio bacterial cum eadem densitate optica saepe centro foraminis applicata est. Putei in operculis parati sunt secundum modum quo in ref. 45 (cf. Accessiones Informationes pro maiori notitia). Adde 1 ml LB medium ad operculationem ne liquor iacuit exarescat. Ultima operculalip praeposita operculo Attofluoris cubiculi clauso ad impediendam evaporationem medii in incubatione. Ad experimenta germinationis sporis usi sumus, quae, post experimenta conventionalia, tectum opercula interdum texerunt. Similis methodus adhibebatur ad obtinendum Sulfolobus shibatae. Tres dies (200 rpm, 75°C) praeliminares culturae Thiobacilli serratae in medio factae sunt 182 (DSMZ).
Exemplaria auri nanoparticula a micellaribus trunco copolymeri lithographia parata sunt. Hic processus fuse describitur in cap. 60. Breviter, micelles in capsulantibus aureis, summatim permixtione copolymarum cum HAuCl4 in toluene permiscebantur. Opercula mundata tunc in solutione immersa sunt et cum UV irradiatione tractata sunt coram agente reducendo ad semina aurea obtinenda. Denique semina aurea per opercularum labrum contingentes cum solutione aquea KAuCl4 et ethanolaminis per 16 minutas factae sunt, quae consecuta sunt quasi-periodico et aequabili dispositione auri nanoparticulorum non sphaericorum prope ultrarubrum.
Interferogrammata ad OT imagines convertere, algorithmum homemadem usi sumus sicut in nexu expressi. 33 et praesto est ut sarcina Matlab in sequenti repositorio publico: https://github.com/baffou/CGMprocess. Sarcina intensio computare potest et imagines OT in interferogramis notata (inclusa imagines referentia) et camera ordinata distantiarum.
Ad calculandum Phase exemplar applicatum SLM ad profile temperaturae datam obtinendam, antea elaboratum homemade algorithm39,42 quod praesto est in sequenti reposito publico: https://github.com/baffou/SLM_temperateShaping. Initus est campus temperatus desideratus, qui digitally vel per imaginem monochromi bmp collocari potest.
Ad cellulas segmentis et pondus siccum metientes, Algorithmum nostrum Matlab in sequenti reposito publico editum usi sumus: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. In unaquaque imagine, usor debet in bacteria vel mCFU usoris preme, lituus suavitatem accommodare et delectu confirmare.
Pro magis notitia de studio consilio, naturam Research Report abstractam huic articulo coniungi videre.
Data subsidia huius studii proventus ex propriis auctoribus in rationabili petitione praesto sunt.
Fons codice in hoc studio usus est in sectione Methodi explicatur, et versiones debug a https://github.com/baffou/ in sequentibus repositoriis deponi possunt: SLM_ temperaturae, CGMprocessus, et CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R. Singhal, P., Singh, H. Damle, D. Sharma, AK Inspectio in thermophilis earumque applicationes late-spectarum. Mehta, R. Singhal, P., Singh, H. Damle, D. Sharma, AK Inspectio in thermophilis earumque applicationes late-spectarum.Mehta, R. Singhal, P., Singh, H., Damle, D. et Sharma, AK Overview thermophilorum eorumque late patet. Mehta, R. Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Mehta, R. Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. et Sharma AK. Thermophilorum profunditas intellectus et amplis applicationibus.3 Biotechnology 6, 81 (2016).
Post tempus: Sep-26-2022